Gentechnik

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DNA-Sequenzierung nach E. Sanger

Das Verfahren zur Bestimmung der Nukleotid-Sequenz einer DNA oder eines ganzen Genoms bezeichnet man als DNA-Sequenzierung.

Wir betrachten hier das Verfahren der DNA-Sequenzierung nach E. Sanger und beschränken uns dabei zunächst auf die Analyse der Nukleotid-Sequenz von einem DNA-Fragment.
Als Ausgangsmaterial für einen Versuchsansatz benötigt man wenige g identischer Stücke dieser einsträngigen DNA.
Einsträngiges DNA-Fragment
g dieser einsträngigen DNA entsprechen
vielen Milliarden DNA-Molekülen

Da die DNA-Fragmente als Matrizen für die Synthese der komplimentären Stränge dienen sollen, benötigt man außerdem Primer , DNA-Polymerase und Nukleotide (in ihrer aktiven Form als Nukleotid-Triphosphate).
Was ist ein Primer?

DNA-Fragmente mit Primer

Der Reaktionsansatz wird in vier Portionen aufgeteilt und die zur Synthese des Doppelstranges notwendigen Nukleotide als Desoxyribonukleosid- Triphosphate dGTP, dATP, dTTP und dCTP werden großzügig dazu gegeben. (Für die Desoxyribonukleosid- Triphosphate schreiben wir im Folgenden kurz G, A, T und C.)
Was sind Desoxyribonukleosid- Triphosphate? Auch wichtig! Um die synthetisierte DNA später nachweisen zu können, hat man die Phosphatgruppen in einem der vier Nukleotid-Typen sind mit radioaktivem P oder S markiert.

Außerdem wird in jedes Reaktionsgefäß eine geringe Menge eines Didesoxyribonucleosid-Triphosphates ddGTP, ddATP, ddTTP oder ddCTP gegeben.
Was sind Didesoxyribonukleosid- Triphosphate?
Wird statt einem normalen Nukleotid (Desoxyribonukleosid- Triphosphat) zufällig ein Didesoxyribonucleosid-Triphosphat eingebaut, so bricht die DNA Polymerase das Anlagern von weiteren Nukleotiden an dieser Stelle ab. Die Didesoxyribonucleosid-Triphosphate ddGTP, ddATP, ddTTP oder ddCTP können wir deshalb kurz auch als Stop-G, Stop-A, Stop-Tund Stop-C bezeichnen.

[Wer lieber mit der korrekten und nicht mit der vereinfachten Darstellung arbeitet, springt besser auf diese Seite.]

Der Reaktionsansatz wird in vier Portionen aufgeteilt:
Die vier Ansätze

G A T C

G + A + T + C G + A + T + C G + A + T + C G + A + T + C

Stop-G Stop-A Stop-T Stop-C

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Wir betrachten hier das Verfahren der DNA-Sequenzierung nach E. Sanger und beschränken uns dabei zunächst auf die Analyse der Nukleotid-Sequenz von einem DNA-Fragment. Als Ausgangsmaterial für einen Versuchsansatz benötigt man wenige g identischer Stücke dieser einsträngigen DNA.	Einsträngiges DNA-Fragment g dieser einsträngigen DNA entsprechen vielen Milliarden DNA-Molekülen
Da die DNA-Fragmente als Matrizen für die Synthese der komplimentären Stränge dienen sollen, benötigt man außerdem Primer , DNA-Polymerase und Nukleotide (in ihrer aktiven Form als Nukleotid-Triphosphate). Was ist ein Primer?	DNA-Fragmente mit Primer
Der Reaktionsansatz wird in vier Portionen aufgeteilt und die zur Synthese des Doppelstranges notwendigen Nukleotide als Desoxyribonukleosid- Triphosphate dGTP, dATP, dTTP und dCTP werden großzügig dazu gegeben. (Für die Desoxyribonukleosid- Triphosphate schreiben wir im Folgenden kurz G, A, T und C.) Was sind Desoxyribonukleosid- Triphosphate?	Auch wichtig! Um die synthetisierte DNA später nachweisen zu können, hat man die Phosphatgruppen in einem der vier Nukleotid-Typen sind mit radioaktivem P oder S markiert.

G	A	T	C

G + A + T + C	G + A + T + C	G + A + T + C	G + A + T + C
Stop-G	Stop-A	Stop-T	Stop-C

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